超高效液相色譜（UPLC）在現代分析檢驗中的應用
隨著現代社會與科學技術的發展，對各種復雜樣品分離分析的要求越來越高，特別是在食品安全、環境監測、藥物開發、生命科學等領域。“更快、更好的得到分析檢驗結果”這是廣大分析工作者的愿望。2004年美國Waters公司推出了世界第一臺最新研制的超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLCTM ) 。UPLC借助HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、低系統體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，它給實驗室帶來了新奇而強大的能力，成為分離分析的一個新興的領域。UPLC的出現大大拓寬了液相色譜的應用范圍和在分離分析科學中的重要地位，為分析化學工作者提供了又一個強有力的技術手段。
圖一：Waters公司 ACQUITY Ultra Performance LC™ （UPLC）
1 UPLC的基本原理
采用細粒徑填料(117μm)和細內徑柱子而獲得柱效高達(100，000 -300，000) 的液相色譜技術， 簡稱超高效液相色譜。UPLC系統是利用創新技術進行整體設計，從而大幅度改善色譜分離度、樣品通量和靈敏度的最新液相色譜技術。相對于當今分析速度最快的高效液相色譜(HPLC)，UPLC的分析速度提高了9倍，分辨率提高了2倍，靈敏度提高了3倍，一次分析所得到的信息量大大超過了高效液相色譜。而這一分離分析領域的創新，是基于著名的van Deemter方程，該方程是一個描述線速度和理論塔板高度(柱效)之間關系的經驗性方程：
上式中， H為塔板高度，A為渦流擴散系數，B為縱向擴散系數， C為傳質阻抗系數，μ為流動相流速。由于式中A、C兩項與填料顆粒度( dp )之間的關系為： A∝ dp； C∝ ( dp)2 ，因而方程式(1)可表達為：
從式(2)可明顯看到，隨著色譜柱中裝填固定相粒度dp的減小，色譜柱的塔板高度H也愈小，色譜柱的柱效越高，說明柱效(N)與顆粒度( dp)成反比：
另一方面，液相色譜分離度與柱效(N)的平方根成正比：
(4)式中k2是容量因子，α是選擇性系數，N是理論塔板數。可見，隨著顆粒度dp的降低，柱效N增加，進而Rs值也增加。由于分離能力用峰容量衡量，單位時間的峰容量越高，表明可以分離出的色譜峰越多，分析的分辨率越高。這也說明了可以通過減小色譜柱中裝填固定相顆粒度來提高色譜柱的柱效和分離度。除提高柱效和改善分離度外，依據van Deemter理論可進一步推測，減小固定相粒度還可在分析速度、靈敏度方面提高色譜分離分析的效能。總而言之，由van Deemter理論可以得到幾點啟示：色譜柱中裝填固定相的顆粒度是對色譜柱性能產生影響的最重要的因素。首先，顆粒度越小柱效越高；其次，不同的顆粒度有各自最佳柱效的流速；最后，更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速(線速度)方向移動，而且有更寬的線速度范圍。所以降低顆粒度不但能提高柱效，同時還能提高分析速度和靈敏度。但是，要真正在技術上實現超高效液相色譜分析，除必須使用小顆粒固定相外，還必須解決色譜系統的一系列問題。如：小顆粒填料的耐壓問題和小顆粒填料的裝填問題，這包括顆粒度的分布以及色譜柱的結構；色譜系統的耐壓問題，包括超高壓下溶劑輸送及系統的耐壓防滲；快速自動進樣與減少進樣交叉污染問題；高速檢測及擴散問題；高速數據的采集及管理、儀器系統控制問題等。只有達成上述這幾個單獨領域的技術創新并進行優化組合，才能促成超高效液相色譜的實現。
圖二：Agilent 1200快速液相色譜儀
2 實現超高效液相色譜的技術條件
為了使液相色譜的分離效率和分離速度等性能上達到新的高度，UPLC在多項色譜技術方面進行了改進與創新。
1)應用雜化顆粒技術合成了新型全多孔球形117μm反相固定相色譜填料，并采用新型的裝填技術，制備了高柱效的色譜柱。
2)制造超高效液相色譜的輸液泵。對10 cm長的裝填117μm顆粒的色譜柱而言，達到最佳柱效的流速時，其計算的理論柱壓約15000 p si。因此需要一個可以在此壓力下傳送溶劑的泵。另外溶劑在此壓力下的壓縮性有顯著變化，尤其是在多溶劑梯度分離條件下。因此為色譜柱裝備了一臺用獨立柱塞驅動，可進行4種溶劑切換的二元高壓梯度泵。此溶劑輸送系統在很寬壓力范圍內具有補償溶劑壓縮性變化的能力，并在等度或梯度分離條件下保持流速的穩定平滑和重現性。
3)超高壓液相色譜的高速檢測器。就理論而言，使用117μm顆粒填料的UPLC系統可以產生半峰寬小于1秒的色譜峰，這就對UPLC的檢測器提出了挑戰。首先當色譜峰通過檢測器時，檢測器必須有一個非常高的采樣速度和非常小的時間常數，使它能夠在整個色譜峰內捕捉到足夠的數據點，以獲得準確、可重現的保留時間和峰面積。其次檢測器的流通池死體積要盡可能小，減少譜帶擴展以保持高柱效。最后檢測器的光學通道要提供能滿足UPLC高靈敏度檢測要求。因此，使用采樣速度達40點/ s或80點/ s，池體積僅為500 nl (約為HPLC池體積的1 /20)的新型光導纖維傳導的流通池。當光束通過光導纖維進入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全折射特征，不損失光能量，而使檢測靈敏度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可變波長的紫外光等。
4)低擴散、低交叉污染的自動進樣器。在HPLC中進樣系統也是非常關鍵的因素，傳統的HPLC中使用的手動或自動進樣閥都不是為極端高壓情況下設計的。在UPLC中為保護色譜柱不受極端高壓力波動的影響，進樣過程應當相對無壓力波動；進樣系統的死體積必須足夠小，以降低樣品譜帶的擴展；快速進樣周期可使UPLC在具有高樣品容量的同時也實現高速度，并使無人照管、長時間運行的自動進樣得以實現，在獲得高靈敏度同時還具有極低交叉污染的小體積進樣能力。
5)實現系統綜合性能的整體優化設計。除了采用以上技術外，還注意各部分之間的連接管線和接頭，整體系統的死體積遠低于常規HPLC系統，現優化的超低系統體積。同時開發創新軟件平臺，控制整套設備。
圖三：VERTEX公司UPLC P5000超高效液相色譜儀
3 應用
目前，超高效液相色譜技術已先后應用于食品安全、環境分析、藥物開發、代謝組學等領域。
3.1 食品安全
YuZhang等應用此技術測定食品中的丙烯酰胺，它提供給我們一種快速定量的方法，僅用3 min 分析完成，結果RSD≤4.5%。催亮等應用UPLC - MS同時測定了牛奶中12種糖皮質激素的殘留，以保留時間和離子對(母離子和兩個碎片離子)信息比進行定性，以母離子和響應值高的碎片離子進行定量，12種糖皮質激素的加標回收率為69.3%～94.3% ，相對標準偏差為3.5% ～16.7 %。E1BarceLo - Barrachina等用此技術分析食品中的雜環胺，僅在3 min 內就完成了16個組分的分離、分析。CristinanC.Leandro等應用此技術檢測嬰兒食品中農藥殘留，對各類相關的嬰兒食品中16種農藥殘留物進行測定，檢測限可達1μg/kg，其檢測速度為HPLC的215倍，平均回收率范圍是85%～119% ，相對標準偏差小于17%。Tomas Kovalczuk等應用此技術分析食品中農藥殘留物，檢測了蘋果樣品提取物中17種半極性農藥，與HPLC比較，此技術提高了樣品的通量，降低了溶劑的消耗量。
3.2 藥物開發
Li Xiaoqin應用UPLC - 電噴霧串聯質譜法分析金蓮花中的有效成分，在20 min內分離出50個峰，其中15種有效成份得到了很好的分離，并進行了結構確認，對四種進行了定量，定量限為515，220μg/g。竇志華等應用UPLC/MS - MS分析復方五仁醇膠囊含藥血清中木脂素類成分，通過比較復方五仁醇膠囊含藥血清、體外制劑、空白血清及對照品提取離子流色譜圖，確認進入血液中的木脂素類成分。J.Guan等應用此技術同時檢測三七中的11種皂苷，相關系數r >0.9968，RSD < 3.1%。Li Xiaojing等應用固相萃取UPLC法分析N-酰胺絲氨酸內脂的5種衍生物(AHLS)，分析時間僅1.5 min，峰可以在濃度低于0.4μm之下觀察到，在SPE過程中，通過增加樣品裝載量，降低洗脫量，能更有效地提高靈敏度。
3.3 環境分析
王靜等應用UPLC - MC分析水中的微囊藻毒素，采用固相萃取法富集凈化樣品。該法在5 min 內即可完成4 種MCYST(LR、RR、LW、LF)的分離及檢測； LR、RR、LW、LF的定量檢測限、回收率分別為1.3～6.0 ng/L，91.1%～111%；工作曲線的線性相關系數大于0.99，線性范圍達到了3個數量級。Marinella Farre等應用UPLC - TOF - MOS在16 min 內完成了水中痕量雌性激素的測定，從而取代了用45 min 才能完成分析的經典HPLC法。
3.4 代謝組學
Anton Kaufmann等應用UPLC - TOF檢測了尿樣中獸藥的殘留。這種方法涵蓋了100多種不同種類獸藥的檢測。此法還可檢測與尿樣有關的某些代謝物，通過監控藥物基團與誘導片段的碰撞進一步得到擴展，例子顯示CID片段的監控恰好就是磺胺類藥物與盤尼西林。Velly A等應用UPLC- TOF - MS檢測了人體尿液代謝物中的對酰氨基酚，UPLC /MS比整體柱的靈敏度提高了3倍，產生的峰更尖銳，可用于檢測更多的代謝物。Yuanguan Ma等應用UPLC-電噴霧質譜法測定人體血漿中的氨氯地平進行藥代動力學研究，定量下限為0.15 ng/ml，精確度RSD < 15% ， RE 2.3% ～6.9%。盧果等應用UPLC-TOF-MS分析尿液中的代謝物，進行區分人類性別的研究，篩選出4種可能與性別相關的生物標準物，結果表明：UPLC /MS聯用技術通量高，數據量豐富，模式識別處理方法適合于從大量數據中提取信息，兩者結合有利于代謝組學的研究。汪江山等將UPLC /TOF-MS用于人參皂甙Rg3作用后大鼠尿液代謝物指紋圖譜分析及標記物的鑒定，對其中2種發生顯著變化的代謝物分別通過準確的質量測定得到其元素組成，通過MS/MS技術得到其結構信息，通過檢索數據庫最終分別鑒定為9，8-二羥基喹啉甲酸和4 -羥基- 2 - 喹啉酸。Gamfeng Wang等應用UPLC /MS分析猴血漿中SCH503034的非對映體，這兩種立體異構體R二1.3可在5 min內分離，線性范圍1～2500 ng/nl， 在2.5， 50，100 ng/nl濃度時回收率為87.2% ～90.0% ， 89.1% ～90.4%和92.3%～94.3%。
3.5 其他領域
近年來隨著人民生活水平提高，化妝品已進入人們的日常生活中，化妝品的安全性指標亦成為消費者關注的問題。然而，化妝品中所添加的化學物質對人體健康具有潛在的危害，化妝品中添加有害物質，輕則會使皮膚過敏，嚴重的會有致癌的危險。因此，對化妝品中違禁物的檢測十分必要。我國化妝品衛生標準、歐盟化妝品規程中均明確規定糖皮質激素、雌激素、雄激素、孕激素等為化妝品中禁用物質。馬強等應用UPLC技術建立了同時測定化妝品中糖皮質激素、雌激素等15種激素分析方法，在6 min 內完成了多組分各類激素的快速分離檢測， 15種激素的工作曲線的線性相關系數r均高于019995，在低、中、高(2、10、20 mg/kg) 3個添加水平下， 15種激素的平均回收率為88.2% ～102.4% ，相對標準偏差為1.6% ～7.4%。
4 結論與展望
綜上所述，UPLC技術的應用，使液相色譜在更高水平上實現了突破。通過這幾年廣大的實驗工作者的努力實踐，使UPLC技術在各行各業得到了很好的應用，這也證明了UPLC技術可行及具有廣闊應用前景。我們看到，在實際應用中，由于UPLC的柱顆粒較小，為防止堵塞，樣品前處理要求更加嚴格。由于系統體積及流量的減小，UPLC比HPLC更節省溶劑，從而更環保及節省費用。UPLC的設計成為質譜儀最佳入口技術，由于UPLC的流量小，使質譜儀的負荷減少，使質譜儀的真空度更好；UPLC分離度的提高，使離子抑制現象減弱，更好的提高了檢測器的靈敏度； UPLC靈敏度的提高，使質譜檢測器靈敏度得到進一步的提升從而實現了分離與檢測的強強聯合。UPLC的高分離度可以幫助分析工作者更加從容駕御復雜組分的分離；它的高靈敏度可以幫助我們解決痕量待測物質分析的難題；同時，它的快速、高通量、節省時間、節約溶劑的優點使UPLC /MS/MS技術成為當今最有效的分離分析工具之一。面對基體復雜的混合痕量組分的分析，特別是蛋白質與代謝組學等生化領域以及天然產物的分析，我們需要精細的微量操作手段和高靈敏度的痕量檢測技術。UPLC的出現極大促進了這些領域的發展，并將得到更好的應用。
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