植物細胞培養技術就是為了某種目的而在細胞水平上對離體植物細胞或原生質體進行的一系列生物工藝學操作。它包括分離、培養、再生以及一系列相關的操作。就有用化合物的生產來說,它主要是指在無菌條件下通過培養植物細胞生產有用化合物的過程。
一、植物細胞培養的特性
(1)植物細胞較微生物細胞大得多,有纖維素細胞壁.細胞耐拉不耐扭,抵抗剪切力差;
(2)培養過程生長速度緩慢,易受微生物污染,需用抗生素;
(3)細胞生長的中期及對數期.易凝聚為直徑達350JJm一400Pm的團塊,懸浮培養較難;
(4)培養時需供氧,培養液粘度大:
(5)具有群體效應;
(6) 因為有細胞壁, 培養細胞產物滯留于細胞內,產量較低;
(7)細胞培養過程有結構與功能全能性,因而易分化,從而導致目的產物低于原植物體內濃度;
(8) 懸浮培養中要求有一定的細胞濃度,否則不生長(25000~50000個/ML)。
二、植物細胞培養需要解決的問題
(1)氧和二氧化碳的控制,過多氧過少氧均不利于生長;
(2)營養物的供應;
(3)細胞密度過高引起細胞團聚甚至分化
(4)培養過程中細胞的分化的防止,
(5)細胞取得中微生物的去除;
(6)細胞壁脆性的存在要求培養體系剪切力要小;
三、培養系統
1、懸浮培養系統
A、 械攪拌式培養系統
機械攪拌式生物反應器通常是根據植物細胞的特性在微生物發酵罐的基礎上作如下改進:
(1)攪拌裝置要減少剪切,一般改葉輪式為螺旋式
(2)因為植物細胞生長周期長,需要隨時補充水分和營養,因此必須設計加液裝置;
(3)由于植物細胞的生理活動需要新鮮空氣,且細胞代謝也可能產生有害氣體,所以必須設計通氣裝置;
(4)便于取樣觀察,一般還設計有取樣口。
B、 氣壓攪拌式培養系統
考慮到機械攪拌式反應器的剪切作用難以避免,同時攪拌器轉動的中軸往往是容易使培養物污染的部位,因此,發展出空氣提升式生物反應器,但其缺點是攪拌不均勻。
C、旋轉式培養系統
一般用于產品中試或某些必需裂解細胞才能獲得目的產物的培養,其優點是控制精確,處理靈活,缺點是培養體積較小。
2、固定化培養系統
在許多愈傷組織和懸浮培養體系中,發現母體植物的細胞不產生次級代謝產物。但是,當發生分化,芽/根或植物胚胎器官組織均可開始分化生產同樣的次級代謝產物。
細胞固定化培養技術按照其支持物不同可以分為兩大類:
包埋式固定化培養系統:支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽b、聚丙烯酰胺等;
附著式固定化培養系統:支持物采用尼龍網、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。
(1) 平床培養系統。
本系統由培養、液罐和動泵等構成。新鮮的細胞被固定在床底部由聚屏烯等材料編織成的無菌平墊上。無菌液罐被緊固定在培養床的上方,通過管道向下滴注培養液。培養床上的營養液再通過動泵循環送回中,本系統設備較簡單,比懸浮培養體系能更有效地合成次生物質。不過它占地面積大,累積次生代謝物較多的滴液區所占比例不高;而且在這密封的體系中氧氣的供應時常成為限制因子,經常還得附加提供無菌空氣的設備。
(2)立柱培養系統
本方法將植物細胞與瓊脂或褐藻酸鈉混合,制成一個個1-2 cm3的細胞團塊,并將它們集中于無菌立柱中。這樣,下滴的營養液流經大部分細胞,亦即"滴液區"比例大大提高,次生物質的合成大為增強,同時占地面積大為減小。
這一技術的優點在于:
細胞位置的固定使其所處的環境類似于在植物體中所處的狀態,相互間接觸密切,可以形成一定的理化梯度,有利于次生產物的合成;
由于細胞固定在支持物上,培養基可以不斷更換,可以從培養基中提取產物,免除了培養基中因含有過多的初生產物對細胞代謝的反饋抑制,也由于細胞留在反應器中,新的培養基可以再次利用這些細胞生產初生產物,從而節省了生產細胞所付出的時間和費用;
正是由于細胞固定在一定的介質中,并可以從培養基中不斷提取產物,因此,它可以進行連續生產。可以較容易地控制培養系統的理化環境,從而可以研究特定的代謝途徑,并便于調節。
植物細胞固定化培養時必須考慮以下幾個問題:
① 所選用的植物細胞的次生代謝產物的產量是否很高,細胞生長速度是否較慢并能維持較長時間的生活能力;
② 所選用的固定支持物對細胞的存活是否有影響,對產物的合成是否有阻礙;
③ 終產物是否能釋放到培養基中,如果產物不釋放到培養基中,是否能采用物理(電擊)或化學(離子滲透法)方法使其釋放而又不影響細胞生活力。
四、植物細胞規模培養技術要點
1.細胞系的建立和選擇
2.優良細胞系的增殖培養
3.大規模培養體系的建立
一步法逐級放大:對于細胞生長與目的產物合成同步的類型,一般采用此方法建立大規模培養系統。
兩步法:用于目的產物合成在細胞生長發育到一定時期進行,細胞生長和產物合成需要不同的培養基的類型。先在細胞生長培養基中培養大批量細胞,當細胞生長至合成產物的階段后,再將其轉入到產物合成培養基中培養。
如果采用固相培養方式生產次生產物,一般均需采用兩步法建立體系。
五.植物細胞規模化培養中的有關工程技術問題
1.懸浮培養系統必須適應植物細胞特性
2.植物細胞培養液的流變特性
3.植物細胞培養過程中的氣體調節
4.泡沫和表面粘附性
5、剪切力對植物細胞的影響