斑點雜交（Dot blot）是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

　　（1）DNA斑點雜交：

　　①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

　　②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

　　③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。

　　④將膜烘干，密封保存備用。

　　（2）RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl

　　DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。

　　（3）完整細胞斑點雜交：應用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。

　　斑點雜交實驗

　　【實驗原理】用地高辛標記的HCV RNA探針檢測HCV RT-PCR產物。

　　【實驗步驟】

　　1. 處理：將尼龍膜浸泡于20×SSC中吸足液體后，夾在兩層濾紙中37℃烘烤20—30 min。（將尼龍膜置入烤箱后立即進行下一步操作）

　　2. 變性：將待測DNA樣品（HCV經RT-PCR擴增產物；HBV的PCR擴增產物作為陰性對照，每組兩種樣品各10μL）置于PCR儀中100℃加熱10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中驟冷5min。

　　（每一排共三組的樣品點在同一張尼龍膜上）

　　【原理】 使DNA樣品變性，即雙鏈DNA→單鏈DNA。

　　3. 點樣：將上述變性后的樣品各2μL點在尼龍膜的毛面上，室溫下風干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。

　　【原理】 使樣品中的DNA與膜結合牢固。

　　4. 預雜交：將雜交膜封入雜交袋中（每兩組的膜背靠背封在一個雜交袋中），做好剪角標記（勿過大）。用1000μL加樣器，加入預雜交液（Dig Easy Hyb），每組5mL全部加完，使尼龍膜恰恰漂起即可，若5mL預雜交液不足，可適當補加。除去氣泡，置42℃恒溫搖床上，輕輕振搖30min-60min。

　　【原理】 封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結合位點。

　　5. 雜交液制備：用預雜交液將探針按100ng/mL濃度稀釋，即為雜交液。

　　（已準備好）

　　6. 雜交：剪開雜交袋一個小角，傾去預雜交液，加入雜交液2-3mL，除去氣泡，封口。置50℃恒溫搖床上，輕輕振蕩過夜。

　　7. 洗膜：（1）回收雜交液；

　　（2）室溫下，用2×wash solution洗膜兩次，每次5min；

　　（3）將0.1×wash solution預熱到50℃洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結合的探針，否則會導致過高的本底。

　　8. 封閉：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培養皿中浸泡1分鐘平衡后，轉入30mL BufferⅡ中，室溫作用30-60min。

　　【原理】封閉雜交膜上非特異性的蛋白結合位點。

　　（在此階段末期，準備下一步的抗體稀釋。稀釋方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL BufferⅡ后輕輕混勻，4℃ 可保存12h。）

　　9. 酶聯抗體結合：將雜交膜封入一個新的雜交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ BufferⅡ中室溫作用30min，經常搖動，使酶聯抗體與地高辛結合。

　　10.洗膜：（1）取出膜，將膜放入含有30mL BufferⅠ的培養皿中，洗膜兩次，每次15min。

　　【原理】洗去未結合的酶聯抗體。

　　（2）取出膜，將膜放入含有20mL BufferⅢ的培養皿中平衡2min。

　　11.顯色：（1）將45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL BufferⅢ中，顯色液必需現配現用！

　　（2）在10mL新鮮制備的顯色底物液中靜止避光顯色數小時，常在12h內完成顯色反應。

　　

　　核酸雜交法檢測病原微生物

　　核酸雜交技術是根據兩條互補的核苷酸單鏈可以雜交結合成雙鏈的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性標記的核苷酸單鏈做探針，與待檢標本中的DNA雜交來探查待檢標本中有無與之相互補的核酸。該方法特異性高，但敏感性低于PCR方法。

　　本實驗學習用非放射性標記物-地高辛(DIG)標記DNA片段作探針，用斑點雜交法檢測病原微生物DNA的方法。

　　 【原理】

　　用地高辛（DIG）類固醇半抗原標記特異DNA片段做探針，與待檢標本中DNA雜交，然后加入堿性磷酸酶標記的抗－DIG抗體（抗DIG-AP），再加入堿性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待檢標本中有與探針同源的DNA序列，則探針與其雜交并與抗DIG-AP結合，堿性磷酸酶催化底物呈色，則在雜交膜上出現蘭色斑點或條帶。該探針可用于斑點雜交，菌落原位雜交及Southern blot雜交。

　　　（一）DIG-DNA探針的制備（隨機引物法標記）

　　　【材料】

　　　　1. 待標記DNA (0.5~3ug)

　　　　2. 六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)

　　　　3. dNTP標記混合物，Klenow enzyme

　　　　4. 其它試劑4M LiCl，無水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0

　　　【方法】

　　　　1. 取待標記DNA(0.5~3ug)，加無菌去離子水至終體積15ul，于沸水浴變性10分鐘后迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　　2. 在冰／氯化鈉上添加：

　　　　2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)

　　　　2ul dNTP mix

　　　　1ul Klenow enzyme

　　　　3. 混勻并短暫離心，然后于37℃孵育至少60分鐘。

　　　　4. 加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反應。

　　　　5. 加入2.5ul 4M LiCl及75ul經-20℃預冷的無水乙醇，充分混勻， -70℃放置30分鐘或-20℃放置2h。

　　　　6. 12000rpm/min離心15min，用50ul預冷的70％乙醇洗滌沉淀物。

　　　　7. 真空短暫干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。

　　　【說明】

　　　　DIG標記的DNA片斷大小為200~1000bp。每次標準標記反應模板DNA量為0.5~3ug，如標記大量DNA需相應增加反應物和反應體積。若延長37℃孵育時間(到20h)可增加DIG標記產物量。

　　　　（二）斑點雜交法

　　　【材料】

　　　　1. 硝酸纖維素膜，待檢標本DNA

　　　　2. 標準預雜交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10體積的10倍濃縮阻斷液(含變性并剪切的鮭精DNA)。

　　　　3. 洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。

　　　【方法】

　　　　1. 雜交膜的制備

　　　　①將從待檢標本提取的核酸（質粒或 染色體DNA）100℃ 10 min 煮沸變性，迅速置冰／氯化鈉中冷卻。

　　　　②膜的處理：用2×SSC ，濕潤均勻，37℃烘干后，即可點樣

　　　　③點樣：取變性待檢核酸1ul 點在硝酸纖維素膜（0.45um）上，同 時設陽性和陰性對照，室溫干燥。

　　　　④80℃真空干燥2h，將DNA固定于膜上。

　　　　2. 預雜交及雜交

　　　　①預雜交：將雜交膜放入裝有適當體積預熱的標準預雜交液的雜交 袋或雜交杯中 ，37℃預雜交 30分鐘，輕輕攪拌使膜在該溫度下孵育。

　　　　②將DIG標記的DNA探針置沸水浴5min后，迅速用冰水冷卻以變 性DNA探針。

　　　　③將變性的DIG標記DNA探針加入到預熱的標準預雜交液(2.5ml／ cm2)中并充分混勻。

　　　　④將雜交膜放到含DIG標記探針的雜交液中。輕輕攪拌，在68℃ 孵育至少6h（對于檢測微量DNA中的單拷貝基因則需孵育16h）。

　　　　⑤雜交后洗滌：用足夠量的2×SSC，0.1%SDS室溫漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過程中需不斷輕輕攪拌。

　　　　（三）免疫學檢測

　　　【材料】

　　　　1. 馬來酸緩沖液（0.1M馬來酸，0.15M Nacl。pH7.5）

　　　　2. 洗液（馬來酸緩沖液加入0.3％吐溫20(v/v)）

　　　　3. 阻斷液（10×濃縮的阻斷液經馬來酸緩沖液10倍稀釋，新鮮配制）

　　　　4. 檢測液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃預熱）

　　　　5. 顯色基底液（加200ul NBT/BCIP濃縮液到10ml檢測液中，新鮮配制）

　　　【方法】

　　　　1. 將經過雜交和嚴格清洗后的膜用馬來酸緩沖液漂洗1~5min；將膜在l00ul阻斷液中孵育30min。 　　

　　　　2. 用阻斷液稀釋抗D1G抗體至適宜濃度(1：5000左右)。

　　　　3. 傾出封閉液，將膜在20ml抗DIG抗體溶液中孵育膜30min；馬來酸緩沖液洗膜2次，每次15min，再用2m1檢測液平衡膜2~5min。

　　　　4. 將雜交膜在現配制的顯色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密閉保存（顯色過程中不能搖動）。

　　　　5. 幾分鐘內可有顏色沉淀形成（16h完成反應，反應過程中可短暫暴露于陽光下以觀察反應進展）。

　　　　6. 當顏色斑點（或條帶）達到一定強度后，可用50ml去離子水或TE溶液洗膜5min以中止反應。 　　

　　　　7. 顯色后的濾膜可封存于聚乙烯袋內或拍照片保存。