一、實驗目的：
  1、掌屋植物染色體標本的去壁低滲方法
  2、了解中期染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)
  二、實驗原理：
  植物細胞有很堅實的細胞壁，染色體很難像動物染色體那樣平整地貼在載玻片上，可通過纖維素酶和果膠酶處理去掉細胞壁；用低滲溶液處理可以提高染色體的分散程度。陳瑞陽等（1979，1982）提出了植物染色體標本制備的酶解去壁低滲法，并在多種植物上得到廣泛應用，成為當前植物染色體研究中的重要方法。

  三、實驗用品：
  （一）器材：
  顯微鏡；溫箱；冰箱；重蒸水；眼科鑷子；刀片；牙簽；載玻片；試劑瓶；三角瓶；量筒；酒精燈；青霉素小瓶
  （二）藥品：
  1、0.2%秋水仙素溶液
  2、Giemsa原液:取Giemsa粉0.5g加入33ml優(yōu)質(zhì)并三醇于研缽中,充分研磨1小時,然后在56℃溫箱中保溫2小時,再加入33ml甲醇(GR或AR級),混勻后裝入棕色瓶中保存?zhèn)溆?貯存時間越久越好.

  3、甲醇（AR級以上）
  4、冰醋酸（AR級以上）
  5、0.075mol/L氯化鉀:稱取氯化鉀5.592g,置于容量瓶內(nèi)加蒸餾水至1000ml
  6、磷酸緩沖液：
  A液：0.067mol/L磷酸氫二鉀
  B液: 0.067mol/L磷酸氫二鈉
  用時將13mlA液和87mlB液混勻即得pH7.6的PBS液
  7、Giemsa染色液（染色前臨時配制）：100mlPBS液+3-5mlGiemsa原液
  8、混合酶液：稱取纖維素酶，果膠酶各0.5g,加入20ml蒸餾水即為2.5%混合酶液,冰箱內(nèi)冰凍保存
  四、實驗材料:
  大麥或玉米種子
  五、方法步驟：
  1、材料培養(yǎng)：將玉米或大麥的種子充分浸種后，擺在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25℃溫箱發(fā)芽培養(yǎng)
  2、預處理：待根長至0.5-1cm時,切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋水仙素的小瓶中預處理2-3小時
  3、前低滲：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化鉀低滲液中，在25℃條件下處理30分鐘。以下可分兩種方法進行處理
  4、第一種方法：
  （1）、酶解去壁：吸去氯化鉀溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25℃下處理1-2小時。
  （2）、后低滲：吸去酶液，慢慢加入(25±0.5) ℃的雙蒸水,輕輕洗一次,然后在雙蒸水中浸泡10-30分鐘
  5、第二種方法：
  （1）吸去前低滲液，立即加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定20-30分鐘
  （2）水洗：將固定好的材料用蒸餾水洗三次，除去材料中的固定液
  （3）酶解去壁：在小瓶內(nèi)加入混合酶液（酶液量以浸過材料為合適），在25℃下酶解30-60分鐘
  （4）后低滲：同4、（2），但是，可適當延長時間至1-1.5小時。
  6、經(jīng)過上述兩種方法處理的材料,可用兩種方法制備染色體標本
  1）、第一種方法,涂片法:
  （1）固定：將后低滲好的材料，直接用甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定30分鐘以上
  （2）涂片：將材料放在預先用蒸餾水浸泡并冷凍的清潔載玻片上，加1滴固定液，然后用鑷子迅速將材料夾碎涂布，并去掉大塊組織殘渣
  （3）火焰干燥：立即將載玻片在酒精燈火焰上微微加熱烤干
  （4）染色：經(jīng)干燥的玻片標本，用Giemsa染色液染色30分鐘，然后用自來水細流沖洗，甩干水珠空氣干燥。
  2）、第二種方法，懸液法：
  （1）制備細胞懸液：倒去雙蒸水，用鑷子立即將材料夾碎形成細胞懸液
  （2）固定：向細胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成細胞懸液
  （3）去沉淀：靜置片刻使大塊組織沉淀，然后取上層細胞懸液于另一個小瓶中。
  （4）去上清夜：將上層細胞懸液靜置30分鐘左右，即可見細胞沉淀，用吸管輕輕吸去上清夜，留約0.5ml左右細胞懸液置備標本
  (5)標本制備:在一張經(jīng)過充分洗凈脫脂,并預先在蒸餾水中冷凍的清潔載玻片上,用吸管滴2-3滴細胞懸液,立即將載玻片一端抬起,并輕輕吹氣，使細胞迅速分散，然后在酒精燈火焰上微微加熱烤干。

  （6）染色：同涂片法（4）
  7、在顯微鏡下尋找典型的中期染色體，注意觀察中期染色體的長臂、短臂和著絲粒位置，并盡可能找到具隨體染色體。
  實驗步驟流程如下：

六、注意事項：
  1、預處理是很重要的一個步驟，必要時可將預處理藥品直接加到培養(yǎng)皿內(nèi)進行活體處理3—4小時，以便獲得更多的中期分裂相。