1、 DNA的分子大小及構型:
　　不同構型DNA的移動速度次序為：共價閉環DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度。

2、 瓊脂糖濃度：
　　一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA段所需膠濃度是 1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

3、 DNA分子的構象 ：
　 　當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因 為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種 DNA。

4、 電源電壓 ：
　　瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA段的分辨率達到最大電場強度不宜高于5V/cm。

5、 嵌入染料的存在 ：
　　熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、 離子強度影響 ：
　 　電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小，幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。