細胞分離技術

一、從原代組織中分離細胞 將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。

從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產量的有活性細胞。

1.胰蛋白酶 (Trypsin)
●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。
●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。
●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
●在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
●通過無菌不銹鋼絲網（100～200mm）過濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進行培養。

2.膠原酶 (Collagenase)
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
●在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。
●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

3.Dispase
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）
●在37℃孵育20分鐘到幾個小時。
●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統最佳條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。
●再次培養時檢測細胞的活性。
●細胞的活率應該超過90％
●對于無血清培養基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移棄使用過的細胞培養基。

2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動培養瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4. 當細胞完全分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。

5. 對于無血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

第三節 細胞的凍存與復蘇

為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，最佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失，最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：
◆包含10％甘油的完全培養基，
◆包含10％二甲基亞砜（DMSO）的完全培養基，
◆50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或
◆50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：
◆50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或
◆包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。

1.懸浮細胞
●計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。
●以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養基中，再次懸浮細胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

2.貼壁細胞
●使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到最小。
●在完全生長培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。
●以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入完全生長培養基中。

1.直接鋪板方法
●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用完全生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。
●培養細胞12到24小時，更換新鮮的完全生長培養基，去除凍存劑。
2.離心方法
●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml完全生長培養基，輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在完全生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。
●細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。

三、細胞的分化、衰老與死亡

1．細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個，可以區分為200多種不同類型的細胞：形態結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發育過程中，細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產生和分化，這個過程在人的一生中一直持續著。

由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2．細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明：

成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細胞衰老過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質結構變化，特異蛋白質成份出現；同時，細胞核，線粒體，膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。

細胞衰老原因，尚無定論，出現過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3．細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環境因素的突然變化或病原物的入侵，導致一部分細胞死去，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。

還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動（代謝、生長、發育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態學、生物學還是生化的特征來說，都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象，凋亡失控的結果將是可怕的：凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。

細胞凋亡與壞死的區別

壞死

形態學特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細胞裂解

生化特征-離子內環境失調,非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生）,隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態）,Postlytic DNA斷裂

生理學特征-影響群組細胞 由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等）,被巨噬細胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應

凋亡

形態學特征-胞膜出芽，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細胞核凝集,最后細胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加

生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生）,以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder）,Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF）,Caspases級聯活化,膜對稱性改變（PS外翻）

生理學特征--只影響單個細胞 ,由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等）,被臨近細胞和巨噬細胞吞噬 無炎癥反應