上世紀70年代以來，受傳統能源價格、環保及資源有限等因素的影響，世界各國日益重視可再生綠色能源，如太陽能、風能、水能和生物能的開發和利用。如我國最近大部份地區出現的霧霾天氣就是由傳統能源的過度使用而造成的，如何盡快轉變能源供給模式，將藍天還給人民，就擺在了我國科研工作者面前。其中各種替代方法中，以利用生物基質（植物、微生物等）開發出的各種生物燃料所帶來的社會效益和經濟效益越來越受到大家廣泛的關注。生物燃料泛指由各種植物或微生物資源可轉化為固體 、液體或氣體形式的一種燃料，具有良好的可貯藏性和易運輸性。然而，傳統方法是使用各種糧食來生產生物燃料（如乙醇），被稱之為第一代生物燃料，但是此方法有其不可避免的缺陷，首先燃料乙醇作為汽油替代品，其水溶性、揮發性、熱值低等缺點制約著其大規模使用，其次以糧食作為原料生產燃料乙醇的這種方法也備受爭議（圖一）。

因此各國科學家都開始研究可替代的先進生物燃料，先進生物燃料(Advanced biofuel)是指以高產非糧作物、農林廢棄物、其他可持續性生物質或者藻類為原料，通過化學、物理、生物甚至必要的組合技術，轉化獲得的具有與化石燃料相當甚至更高能量密度，易于儲存和運輸的燃料分子。先進生物燃料研究目前有兩個方向， 其一是通過改造微生物代謝途徑而直接生產可被利用的生物燃料，如美同加州大學洛杉磯分校學者通過合成生物學手段改造大腸桿菌Escherichia coli氨基酸生物合成途徑，合成了一系列碳鏈稍長的醇類化合物，并且大幅度提高了產量，為生物汽油發展提供了新思路；其二是針對傳統微生物（如大腸桿菌、酵母菌等）改造，使其能夠合成特異性酶類分解纖維素，從而生產生物燃料；如前些年美國麻省理工學院的一個學生研究小組發明了一種用微生物產生的酶類來分解廢棄植物纖維產生電能的生物燃料電池，它可專門用來為手機充電。眾所周知纖維素是地球上最豐富的可再生自然資源，例如我國每年僅作為秸稈的纖維素產量就達2億噸以上，那么如果將如此豐富的自然資源轉化為生物燃料將是一種不錯的選擇。

 

我們知道有些纖維素具有很強的抗降解屏障，而傳統化學降解的方法需要強酸和高溫的一個環境，即污染了環境又增加工業生產成本，而采用纖維素降解酶的方法與化學降解方法相比較具有很多優勢，但是目前也存在很多有待解決的問題，如有些纖維素酶由于其熱穩定性差、pH耐受范圍較窄以及活性低而無法滿足不同工業應用需求，需要挖掘具有高活性和穩定性的新纖維素酶，很多能夠篩選出的具有高生物活性和高穩定性的纖維素酶的細菌、放線菌或真菌（圖二），但在實驗室條件下很難進行純培養。如何有效彌補某些微生物在無法適應實驗室環境下進行純培養呢？

 

 

環境微生物基因組，也稱之為宏基因組，通過對其篩選能夠有效的幫助我們解決上述問題。宏基因組學誕生于上世紀90年代，是指不經過微生物培養階段，采用直接提取環境中總DNA的方法（目前主要指環境中細菌和真菌基因組總和），對微生物基因總和進行研究的一門新學科。宏基因組技術的出現，使得人們對占微生物總體99% 以上不可純培養的微生物的研究成為現實。它的應用主要有兩方面：一方面是篩選功能基因, 開發具有所需功能的蛋白，另一方面是通過對宏基因組文庫進行分析, 探討在各種環境下微生物間相互作用和微生物與周圍環境間相互影響的規律。在宏基因組技術的應用范圍被不斷擴展的同時, 圍繞著宏基因組文庫的構建、篩選、測序和分析等方面的研究已成為宏基因組學發展的主要推動力。文庫的構建的方法是在環境樣品中提取基因組DNA，根據序列的大小將其克隆到合適的載體（質粒、粘粒或者細菌的人工染色體中），可導入不同的宿主菌體（如大腸桿菌、鏈霉菌或假單胞菌）中，來篩選出目的轉化子。我們知道一個好的基因組文庫的大小應足夠大，以便包括所有的基因DNA 順序，目前很多用戶采用傳統人工轉化培養、挑選克隆方式，這種方式有些不可避免的缺陷，首先其增加勞動人員的工作量，其次由于人為原因可能出現誤挑、挑選出的克隆來源無法追蹤，工作效率低等。往往我們挑選成千上萬的單克隆后，僅能獲得幾個具有活性的克隆。如何提高陽性克隆篩選效率和準確性，使實驗人員從簡單重復的勞動中解放出來，成為了大家關注的焦點。

 

1991年成立于英國Genetix公司一直致力于高通量全自動微生物克隆篩選系統的研究和開發，并于1993年推出了世界上第一臺QPix高通量全自動微生物篩選系統。經過二十年的發展，目前QPix系統在全球有超過600臺的裝機量，因此它也建立了微生物克隆篩選方面的行業標準，已知世界八大測序中心，其中有七家采用了QPix系統，2011年Genetix公司加入Molecular Devices公司，而后Molecular Devices根據市場的需要，研發并推出了最新Qpix 400系列高通量全自動微生物篩選系統，目前包括QPix460、Qpix450和QPix420高中低三種型號（圖三）。

 

圖三：QPix460高通量全自動微生物克隆篩選平臺 

 

QPix460能夠幫助實驗人員完成從轉化涂板、克隆篩選、文庫復制重排等全部工作。QPix400系列產品采用了最新的磁懸浮傳動裝置，可以有效的提高篩選速度和精確性，QPix400系列高通量全自動篩選系統每天可以挑選30000克隆，而傳統人工方式一人一天最多挑選2000個克隆。且QPix高通量微生物篩選系統也采用了特殊金屬材質的挑針（圖四），優勢之一是具有較高的強度和壽命、利于挑針的清洗消毒、又能提高挑選精度和準確性（精度＜10um、準確性＞98%）；優勢二既有針對不同微生物類型挑針，如有針對大腸桿菌、酵母菌和噬菌體的挑針，也有針對不實驗方法的挑針，如挑選挑針、復制挑針、點膜挑針等。

 

 

QPix400系列產品中加入了條形碼讀取器和培養基高度自動檢測功能（圖五），其中條形碼讀取器可以幫助用戶在建庫的時方便數據記錄和追蹤，而高度自動檢測功能的原理是利用了超聲波探測技術，能準確探測出培養基的高度，可對挑針Z軸的高度進行優化。

 

 

目前大家普遍利用含有剛果紅染料的羧甲基纖維素（CMC）瓊脂作為培養基，通過宏基因組學篩選方法已經成功的從各種土壤、水牛瘤胃和白蟻后腸中，獲得了幾株有活性的纖維素酶。然而CMC篩選的方法缺點是不適合高通量篩選、且不能定量及信噪比差等缺點。也報道過其它一些方法，但是多數以瓊脂平板作為試驗的基質，并不能適合大片段基因組庫的高通量篩選。Mewis K等發表在Microbiology and Immunology的一篇文章中提到了利用二硝基酚（DNP）作為纖維素酶底物來顯色的方法，他們將文庫克隆在pCC1拷貝控制福斯質粒載體上，通過增加拷貝數目來增加檢測靈敏度，此方法可一步顯色后，利用具有光吸收功能的酶標儀檢測其吸光度變化，這種檢測方法具有可定量、靈敏度高及全自動化優勢。在進行檢測以前，首先將構建好的文庫（N塊384孔板，-80℃取出。放在37℃半小時左右）然后將整板的384孔板進行復制，傳統手工方法效率很低，他們利用了Molecular Devices公司的QPix高通量全自動微生物克隆篩選系統所具有的微孔板復制功能，專用的復制挑針，復制挑針模塊有兩種不同的規格，96根針或384根針，分別對應96孔板或者384孔板，其中96根挑針模塊也可以兼容384孔板。如復制10塊384板孔（384根針挑頭），復制完畢只需要15分鐘，大大提高了勞動效率。

 

如篩選出各種酶類都需要進行酶活力評價，傳統方式準確率、效率都較低。酶活力評價法就可以利用熒光法作為一種手段，其具有靈敏度高、特異性好等優勢，將熒光標記物與目標基因構建于表達載體中轉化培養，根據熒光強度高低選擇克隆，傳統方式需人工在熒光顯微鏡下進行克隆挑選，工作強度大，QPix400系列高通量全自動微生物克隆篩選系統不但具有亮視場白光成像功能，同時還具有多通道熒光成像功能，這樣會大大縮短酶活力評價過程，提高效率(圖六)。

 

 

生物燃料作為一種全新能源具有無可比擬的優勢，如何加快生物燃料的研發，促進其適應工業化大規模生產，關鍵是如何在較短時間內快速找到特異性、高產量的微生物，可加速生物燃料發展，高通量篩選儀器作為一種必不可少手段會發揮出越來越大的優勢。