上海惠誠生物提供的RAA和RT-RAA擴增試劑是基于重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術開發的恒溫核酸擴增檢測試劑，在39～42℃恒溫條件下特異識別并擴增目標樣本的核酸片段，可配合電泳法、實時熒光或通用型核酸檢測試紙條進行檢測判斷。

可試用產品：2023年6月1日到9月30日

HP80201 基礎型RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）

HP80202 熒光型RAA 核酸擴增試劑（凍干顆粒）

HP80203 基礎型RT-RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）

HP80204 熒光型RT-RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）

HP80205 試紙條型RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）

HP80206 試紙條型RT-RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）

儲存及有效期

本產品存儲于2~28℃、干燥、避光條件下，有效期為12 個月。

產品用途

RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）可應用于核酸DNA 的快速擴增。

RT-RAA核酸擴增試劑（凍干顆粒）可應用于核酸RNA的快速擴增。

技術原理

重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴增技術。RT-RAA先利用逆轉錄酶將 RNA 逆轉錄成 cDNA，從細菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結合，形成重組酶/引物復合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結合蛋白結合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態。重組酶/引物復合體開始對雙鏈進行掃描，當引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補序列時，重組酶/引物復合體解體，DNA聚合酶結合到引物的3'端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴增產物以指數級增長，完成靶標基因的擴增。經過熒光標記的探針與擴增產物結合，當探針被核酸內切酶酶切后，與生物素標記的引物共同擴增形成兩端有熒光標記及生物素標記的片段，可用電泳法、熒光法或通用型核酸檢測試紙條進行判讀。如下圖所示：

本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強等優點，反應組分已混合并冷凍干燥成核酸擴增試劑，操作簡便，易于保存。

引物設計

RAA核酸擴增技術對引物設計的要求與常規PCR引物設計有一定的區別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標物的上下游核苷酸序列；引物長度在28-35 nt之間，序列中無回文序列、連續單堿基重復序列和內部二級結構區；引物Tm值不作為設計時主要考慮因素。建議在開展RAA（基礎型）擴增反應之前，先進行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

探針設計建議方法：探針長度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基；探針的5'端用一種抗原標記物標記，通常為FAM基團或羧基熒光素；內部含有堿基核苷酸類似物替換核苷酸（例如四氫呋喃殘基THF-有時稱為'dSpacer'）；3'末端有聚合酶延伸阻斷基團（例如C3-spacer，磷酸基或雙脫氧核苷酸）。如下圖所示：

注意：在開始實驗前檢查探針5'端標記的基團與下游引物5'端標記的基團是否與所用的試紙條相匹配；建議在開展 RAA試紙條型擴增反應之前，先進行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

產品說明

1. 本產品是“Ready to Use”即用型 RAA/RT-RAA 凍干顆粒；含有除引物和探針外所有的反應要素，如重組酶、DNA 聚合酶、逆轉錄酶、dNTP、ATP和PEG 35000等。

2. 試劑盒最低檢測下限為 10-100copies/測試（依據引物篩選優化程度和檢測手段）。

3. RAA試劑，僅擴增DNA，RT-RAA能同時擴增DNA和RAA。

4. 基礎型試劑，適用于電泳法分析條帶。

5. 熒光型試劑：含有外切酶（EXO）可使用探針法，進行實時熒光監測。

6. 試紙條型試劑：含有外切酶適用于熒光法和試紙條法分析擴增產物。

適用儀器

恒溫金屬浴、恒溫水浴鍋、熒光PCR儀。

檢測步驟

1. 核酸樣本提取：請參考傳統RNA/DNA 提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA/RNA樣本。

2. 樣本檢測
2.1 反應體系： 單管反應體系（25μL）：

2.2 操作步驟

2.2.1 根據反應數量，按照反應體系配制含有水、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)的 Mix，混合均勻后加入裝有核酸擴增試劑的檢測單元管中；

2.2.2 向檢測單元管中加入經步驟1處理得到的待測RNA樣本；

2.2.3 再向檢測單元管蓋上加入1.5~2.5 μL 的Mg2+，蓋上管蓋，上下顛倒 輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻”將決定實驗結果的重復性）

2.2.4 將檢測單元管放入37~40℃ 恒溫金屬浴（或恒溫水浴鍋）中，孵育30min。熒光法則每隔30秒，采集一次熒光信號。

2.2.5 試紙條檢測：反應結束后，將25μL反應體系液用無菌水或者PBS稀釋（25μL反應體系液:150μL稀釋劑），利用通用型核酸檢測試紙條進行檢測。

結果分析與判定

可以根據瓊脂糖電泳、試紙條或熒光法判定實驗結果。