傳統(tǒng)的Western Blot，耗時長，手工操作多，重現(xiàn)性差（CV>35%）。遇到珍貴樣本（蛋白量不足）通常會進(jìn)行strip-reprobe（洗脫-重雜交）的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)多靶點(diǎn)的分析。

然而，傳統(tǒng)Western Blot進(jìn)行strip-reprobe（洗脫-重雜交）時會面臨：

1.洗脫次數(shù)不夠，無法充分解離靶點(diǎn)和抗體，影響二次雜交。

2.洗脫次數(shù)太多，膜上靶點(diǎn)丟失太多，定量更加不準(zhǔn)。

3.每個靶點(diǎn)和抗體親和力不同，沒有通用試劑和方法。
 

為了克服這些局限性，

ProteinSimple Jess RePlex技術(shù)正式上線！！
 

Jess RePlex檢測技術(shù)特點(diǎn)：

• 只需1份3μl樣本(分選干細(xì)胞、免疫微環(huán)境細(xì)胞、珍稀臨床樣本等）

• 2次連續(xù)自動檢測：一根毛細(xì)管洗脫-重雜交技術(shù)

• 結(jié)合Jess多通道檢測：化學(xué)發(fā)光、雙色紅外熒光、總蛋白檢測通道

• 實(shí)現(xiàn)珍貴樣品多靶點(diǎn)的定量檢測分析（不同靶蛋白、靶蛋白不同亞型、靶蛋白磷酸化、樣本總蛋白等）
   

Jess RePlex檢測原理：

Jess RePlex應(yīng)用舉例：

RePlex超高的洗脫效率
 

RePlex中的關(guān)鍵步驟是在第一輪探測后能有效去除抗體。因此，評估了針對Jurkat和MCF7裂解物的pan AKT/AKT1/AKT2/p-AKT1/p-AKT2/p-GSK3b抗體的去除效率。結(jié)果顯示，所有測試的抗體均顯示出超過96％的去除效率，而大多數(shù)測試的抗體均顯示出98％或更高的去除率。這些數(shù)據(jù)表明進(jìn)行第二輪抗體探測時，與第一輪探測幾乎沒有交叉。
 

RePlex出色的重雜交信號強(qiáng)度和高重復(fù)性

為了證明探針1和探針2之間的信號強(qiáng)度和可重復(fù)性沒有受到影響，在兩個檢測步驟中測量了MCF7裂解物中AKT1和AKT2抗體的信號強(qiáng)度。結(jié)果顯示，不管檢測每種蛋白質(zhì)的順序如何，在RePlex分析中在探針1或探針2中檢測到的MCF7裂解物中的AKT1和AKT2在兩個檢測周期中均具有出色的重現(xiàn)性和相似的信號強(qiáng)度。
 

一份樣品不同靶點(diǎn)的檢測
 

RePlex檢測技術(shù)可以檢測同一樣品中多種蛋白質(zhì)磷酸化的狀態(tài)變化，并對其進(jìn)行定量分析（使用對照和經(jīng)LY294002處理的Jurkat細(xì)胞的裂解物的p-AKT/p-GSK3b/p-cRaf的定量分析）。
 

一份樣品相近分子量靶點(diǎn)的檢測
 

利用RePlex技術(shù)表征了多種組織類型中AKT的磷酸化狀態(tài)。同一毛細(xì)管中檢測多種組織類型，包括肝，腎，結(jié)腸，腦，乳腺和肺中的panAKT和p-AKT。同時分析了不同組織中歸一化panAKT后，p-AKT信號的變化，即不同組織顯示出不同水平的AKT表達(dá)和磷酸化。
 

一份樣品多靶點(diǎn)的檢測

利用RePlex技術(shù)可以在第一輪免疫雜交中進(jìn)行不同靶蛋白的測定，并在同一毛細(xì)管中進(jìn)行第二輪總蛋白檢測。利用未經(jīng)處理和用人IGF1（hIGF1）處理過的MCF7細(xì)胞，第一輪檢測Pan AKT（NIR通道）和p-AKT（化學(xué)發(fā)光通道），第二輪檢測同一根毛細(xì)管中的總蛋白。結(jié)果顯示，利用Jess不同通道以及RePlex技術(shù)可以達(dá)到一份樣品獲取多個靶點(diǎn)的定量數(shù)據(jù)。
 

結(jié)論：

傳統(tǒng)Western Blot若從單個樣本中獲取更多的蛋白信息，即為了節(jié)省珍貴或昂貴的樣品，需要進(jìn)行strip-reprobe（洗脫-重雜交）。然而，眾所周知該技術(shù)會遭受不可預(yù)測的蛋白質(zhì)損失，并且通常需要冗長的優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)最佳的剝離效率并使蛋白質(zhì)在印跡上的保留最大化。這使得幾乎不可能使用標(biāo)準(zhǔn)的條帶和探針技術(shù)進(jìn)行任何定量分析。相比之下，Simple Western平臺Jess開發(fā)的RePlex技術(shù)是一種優(yōu)化的自動化兩步免疫分析，可以實(shí)現(xiàn)多個靶標(biāo)的高效抗體去除和出色的目標(biāo)蛋白在樣品毛細(xì)管中的保留，從而可以實(shí)現(xiàn)在一個樣品中獲得更多的蛋白信息。