摘要

隨著小鼠基因組序列測序完成，許多研究都圍繞著功能基因參與的生物學過程，特別是發育和疾病研究領域。那么穩定遺傳修飾的模型動物對于闡明基因的作用十分重要，然而，傳統的方法，包括在胚胎干細胞中的同源重組或是構建小鼠嵌合體，既耗時又耗力。然而新的基因組編輯方法明顯的優化這個過程。在有效的基因組編輯方法中，CRISPR/Cas9系統是構建攜帶修飾基因組最簡單的方法。

雖然，CRISPR/Cas9系統簡化了形成突變體的過程，但是將DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技術，得到大量的突變體也十分耗時間（注射數以百計的受精卵）。那么，為了簡化這個過程，我們嘗試用電轉化儀將RNA導入受精卵。

電轉也被用于過小鼠受精卵，但是過程涉及去除卵透明帶，或是用酸臺氏液薄化處理，這些對細胞是非常有毒性的，而且只有短小的RNAs（短于1kb）可以被導入。

近期，一只大鼠突變體成功構建，借助于在保持卵透明帶完好的前提下轉染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因組編輯的效率很低（低于9%），而且需要大量的Cas9（1000-2000ng/ul）。

方法與結果

為了優化電轉條件，我們使用BEX CUY21 EDIT II電轉化儀，以及鉑金塊電極，1mm間隔（圖1abc）。放在體視顯微鏡下，并連接電轉化儀。每次加入5ulRNA，可以電轉40-50個胚胎。

為了提高基因組編輯效率，分別借助mCherry mRNA和無肢基因Fgf10，優化參數，得到電轉受精卵存活并發育成兩細胞階段的比率是94-95%，比微注射方法34-35%要高很多。

當我們使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA進行轉染，87%的胚胎表現出缺失前、后腿，是圖2c（type I）；10%的突變體是肢體殘缺（type II）;只有3%的胚胎表現為正常（type III）。對I型突變體進行測序，發現Fgf10基因等位基因全部被打斷。

隨后，我們檢測了不同濃度的Cas9mRNA和gRNA對于基因編輯的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，73%的胚胎無肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢體殘缺（圖2bc）；50ng/ul Cas9 mRNA和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。

Figure 1. Optimal conditions for the electroporation used to deliver mRNA into fertilized eggs. (a) Electroporation set-up used in this study. The right box is the electroporator CUY21 EDIT II (BEX Co.Ltd.), which generates electric pulses, and the left is a stereoscopic microscope for embryo manipulation. Two electrodes were placed on the microscope stage and connected to the electroporator.

 

Figure 2. CRISPR/Cas9-mediated genome editing by electroporation. (b) Examples of embryos from the three classes that exhibited different limb phenotypes: no limbs (type I), limb defects (type II, left hind limb deficiency, right: truncated fore- and hind-limb), and normal (type III). (c) Graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electroporation on limb development. The concentrations of RNAs used in each experiment are shown at left The numbers in each column are the number of embryos exhibiting the phenotype in each category

Figure 3. The single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN)-induced generation of HDR-mediated
insertions. (b) Representative embryo electroporated with Cas9 mRNA, gRNA, and ssODN. The mCherry florescence completely disappeared in the electroporated embryos, while control (no electroporation) embryos displayed florescent signals.

為了確定基因組編輯的高效，轉染mCherry入11只小鼠中，發現所有11個小鼠都沒有紅色熒光（圖3b）。這一結果說明電轉染的方法還可以用于高效產生HDR介導的基因敲除小鼠。
接下來，我們揭示了這種突變是否會在下一代中遺傳下來。電轉200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵細胞，靶向mCherry基因。觀察25只F0代小鼠，均無紅色熒光表達。而且所有的F1代小鼠同樣沒有紅色熒光，而且mCherry基因被打斷。說明基因編輯突變體可以穩定遺傳。
討論
綜上所述，我們確立了一個電轉條件，保證基于CRISPR/Cas9的基因組編輯的高效和高存活率。因為電轉染不需要微注射技術，而且可以同時對40-50個胚胎進行處理，這種方法較之以前的方法能更快更簡單的得到大量的穩定遺傳突變體小鼠。應用這個方法，可以為分析F0表型進而篩選發育相關重要基因奠定基礎。